|
Rus
реагенты, оборудование
Лаборатория, анализы | 495 | 589-14-03
Вход для клиентов
Забыли пароль?  |  Регистрация

Основы метода ПЦР

Полную версию вы можете прочитать, скачав документ Основы метода ПЦР.

Основы метода ПЦР

Полимеразная цепная  реакция (ПЦР) в настоящее время широко используется в исследовательских и клинических лабораториях всего мира. В основе метода ПЦР лежит процесс многократного увеличения копий (амплификации) определенных участков ДНК, осуществляемый с помощью фермента ДНК-полимеразы.

Основные компоненты реакционной среды.  Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо наличие в реакционной смеси следующих компонентов:

ДНК-матрица  — выделенная ДНК анализируемого образца, содержащая искомый специфический фрагмент

Праймеры  — синтетические олигонуклеотиды размером 15-30 пар нуклеотидов, комплементарные прямой и обратной цепям определяемого фрагмента и ограничивающие его; играют ключевую роль в образовании продуктов реакции и обеспечивают чувствительность и специфичность реакции;

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ)  — смесь четырех нуклеотидных оснований, «строительных блоков» для синтеза новых комплементарных цепей ДНК

Taq-полимераза  — термостабильный фермент, катализирующий удлинение новой цепи ДНК

Буферный раствор  — реакционная среда, содержащая различные ионы, в том числе ионы Mg2+, необходимые для поддержания оптимальной активности и стабильности фермента

Этапы проведения амплификации. Для получения достаточного для визуализации количества копий целевого фрагмента ДНК необходимо провести 20-40 циклов амплификации, каждый цикл включает в себя несколько стадий:

Инициация  — необходима в случае, если активация ДНК-полимеразы происходит с помощью нагревания при высоких температурах, реакционную смесь выдерживают при 93-96°С в течение нескольких минут.

Этап 1. Денатурация  — реакционную смесь нагревают при 93-95°С в течение 30-40 сек., происходит расплетение двойной спирали ДНК с образованием одноцепочеченых молекул.

Этап 2. Отжиг праймеров  — происходит комплементарное связывание праймеров с ДНК-матрицей, температура отжига специфична для каждой пары праймеров и ее значения располагаются в интервале 50-65° С, реакция протекает в течение 10-40 сек.

Этап 3. Элонгация цепи  — происходит синтез новых цепей ДНК Taq-полимеразой путем удлинения праймеров в направлении от 5'-конца к 3'-концу. Как правило, реакция протекает при 68-72°С, время проведения элонгации зависит от размера амплифицируемого фрагмента.

Образовавшиеся в ходе первого цикла амплификации новые молекулы ДНК служат матрицей для второго цикла репликации ДНК, таким образом, происходит экспоненциальное накопление целевых фрагментов ДНК (ампликонов) в реакционной смеси. За 30-40 циклов амплификации в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Такого количества достаточно для визуального обнаружения ПЦР-продукта методом электрофореза в агарозном геле.

Стадии проведения ПЦР-анализа  реакция (ПЦР) Проведение анализа с использованием метода ПЦР включает три основных этапа:

1. Выделение генетического материала из клинического образца  — На данном этапе клинический образец подвергается специальной обработке, выбранная методика выделения нуклеиновых кислот зависит от характера анализируемого материала. Для проведения амплификации необходима ДНК (РНК), свободная от клеточных фракций и посторонних примесей, которые могут ингибировать реакцию ПЦР.

2. Амплификация специфического фрагмента ДНК  — На данном этапе происходит накопление целевых фрагментов ДНК, процесс амплификации проводят в специальных программируемых термостатах, автоматически меняющих температуру реакционной смеси по заданной программе. Скорость «наработки» фрагмента зависит от эффективности ПЦР, при максимальной эффективности достаточно 38-40 циклов для получения 25-50 нг/мкл ампликонов из одной исходной молекулы ДНК.

3. Детекция продуктов амплификации  — Можно выделить два основных метода детекции продуктов амплификации: детекция в агарозном геле и флуоресцентная схема детекции. В первом случае происходит электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов в агарозном геле согласно размеру фрагментов ДНК. Более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. Визуализация ампликонов в геле проводится путем добавления к ним интеркалирующего агента – бромистого этидия, который встраивается в двуцепочечные цепи ДНК и флуоресцирует в оранжево-красном диапазоне видимого спектра при УФ -облучении. В зависимости от количества конечного продукта яркость свечения полос может быть различной, но дать количественную оценку ДНК-копий с помощью этого метода невозможно. Альтернативой электрофоретическому методу является использование флуоресцентных методов, где специальные флуоресцентные зонды гибридизуются со специфической последовательностью ДНК-матрицы. Уровень флуоресценции пропорционален количеству образовавшихся специфических продуктов ПЦР. Детекция может проводиться либо в процессе амплификации (ПЦР в режиме реального времени), либо после завершения реакции (ПЦР с детекцией по конечной точке).

Метод ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний  — Использование метода ПЦР в современной медицинской практике для диагностики инфекционных заболеваний открывает новые возможности для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии. Это быстрый, точный и высокочувствительный метод выявления большинства инфекционных возбудителей бактериальной и вирусной природы, а также простейших и грибов. Применение тест-систем ПЦР особенно эффективно для обнаружения трудно культивируемых и некультивируемых в лабораторных условиях видов микроорганизмов, в том числе внутриклеточных микроорганизмов, способных длительно персистировать в организме хозяина и не выявляющихся традиционными микробиологическими методами. С появлением метода ПЦР в реальном времени стала возможной оценка наличия инфекционного агента как качественно, так и количественно, что во многих случаях позволяет не только уточнить диагноз и выбрать оптимальный метод лечения, но и оценить эффективность терапии.

Цена на ПЦР

Цены на ПЦР колеблется в зависимости от от количества возбудителей, наличие или отсутствие которых необходимо определить. Узнать о том, какова ПЦР цена в индивидуальном случае пациент может у врача. Приобрести тест-системы ПЦР Вы можете в научно-производственной фирме «ЛИТЕХ».


Скачать прайс-лист Скачать прайс-лист
Лицензии. Сертификаты. Регистрационные удостоверения Лицензии. Сертификаты. Регистрационные удостоверения
Поликлиника НИИ Физико-химической медицины Поликлиника НИИ Физико-химической медицины
НИИ Физико-химической медицины НИИ Физико-химической медицины
Медицинские анализы Медицинские анализы www.analyz24.ru
О нас  | 
© Литех 1992-2016.
Разработка сайта - InterLabs.