|
Rus
реагенты, оборудование
Лаборатория, анализы | 495 | 589-14-03
Вход для клиентов
Забыли пароль?  |  Регистрация
Главная > Методическая информация > Научные статьи > Выявление устойчивости микроорганизмов к антибиотикам методом ПЦР

Выявление устойчивости микроорганизмов к антибиотикам методом ПЦР

 

2012 г.  Л.А. Струкова, И.А. Парфенов

ООО НПФ "Литех"

Сегодня при бактериальных инфекциях наиболее часто назначаются β-лактамные антибиотики, среди которых различают пенициллины (ампициллин, метициллин), цефалоспорины (цефтриаксон, цефиксим) и карбапенемы (имипенем, меропенем). Они имеют долгую историю использования, являются безопасными и эффективными против широкого спектра бактериальных возбудителей инфекций. Однако масштабное и долгосрочное использование противомикробных препаратов этого класса привело к появлению и распространению микроорганизмов, реализующих лекарственную устойчивость за счет продукции различных вариантов β-лактамаз - ферментов, разрушающих β-лактамные антибиотики, либо за счет модификации пенициллин-связывающих белков (ПСБ), являющихся мишенями действия для β-лактамных антибиотиков (1).

Результаты научных исследований указывают на необходимость определения чувствительности перед назначением антимикробной терапии (2). Знание бактериальной резистентности к антибиотикам имеет важное значение для успешной борьбы с болезнью.

Назначение несвоевременной и неадекватной терапии внутрибольничных и тяжелых инфекций увеличивает вероятность летального исхода. Поэтому очень важно на ранних стадиях заражения выявить тип антибиотикорезистентности, чтобы подобрать адекватную схему лечения и использовать наиболее эффективные антибактериальные препараты. В случае тяжелых инфекций это нужно сделать в кратчайшие сроки.

В отличие от традиционных микробиологических методов, метод ПЦР позволяет проводить идентификацию генетических детерминант резистентности микроорганизмов, в том числе сложно культивируемых бактерий, в течение 4 часов. Он отличается высокой точностью и меньшими требованиями к забору материала, не требует наличия питательных сред, дисков с антибиотиками и дополнительных реактивов. Определение антибиотикорезитентности с помощью ПЦР позволяет спрогнозировать появление устойчивости к различным группам антимикробных препаратов, а также оценить распространение резистентных штаммов на локальном и региональном уровнях. Поэтому обнаружение антибиотикорезистентности методом ПЦР является отличным дополнением к традиционному микробиологическому тестированию.

В современной клинической практике можно выделить несколько вариантов антибактериальной резистентности, приводящих к крайне серьезным социально-экономическим последствиям. К таким вариантам относятся:

• устойчивость к β-лактамным антибиотикам среди грамотрицательных бактерий, в частности Enterobacteriaceae и P.aeruginosa, связанная с продукцией β-лактамаз;

• устойчивость к гликопептидам среди Enterococcus spp.;

• устойчивость к β-лактамным антибиотикам среди Staphylococcus aureus;

• устойчивость к фторхинолонам среди грамположительных и грамотрицательных бактерий;

• устойчивость к макролидам среди Streptococcus spp.

Большинство из перечисленных вариантов обусловлено приобретением бактериями данной группы той или иной генетической детерминанты устойчивости (таблица 1), обнаружение которой возможно с помощью ПЦР.

Таблица 1

Антибиотикорезистентность-таблица-1

 

В ООО НПФ «Литех» разработана серия ПЦР-наборов для обнаружения генетически обусловленной устойчивости микроорганизмов к антибиотикам.

Грамотрицательные бактерии, в том числе возбудители нозокомиальных инфекций, как правило, реализуют устойчивость к β-лактамным антибиотикам за счет продукции многочисленных β-лактамаз, при этом один штамм может продуцировать несколько различных ферментов. Продуцируемые бактериями ферменты различны по своей субстратной специфичности, среди них выделяют следующие типы:

• пенициллазы, гидролизующие только пенициллин и ампициллин;

• бета-лактамазы расширенного спектра действия (ESBL), гидролизующие пенициллины и цефалоспорины;

• и наконец, металло-бета-лактамазы, или карбапенемазы, гидролизующие пенициллины, цефалоспорины и карбапенемы.

Генотипирование на основе ПЦР остается золотым стандартом детекции и идентификации β-лактамаз, в том числе металло-бета-лактамаз. (3).

Необходимость обнаружения генов blaSHV, blaTEM, ответственных за продукцию пенициллаз, или β-лактамаз узкого спектра действия (NSBL)

Штаммы, продуцирующие β-лактамазы узкого спектра действия (NSBL), обычно вырабатывают TEM-1 и/или SHV-1 ферменты, которые разрушают пенициллины и ранние цефалоспорины, но чувствительны к другим классам β-лактамных антибиотиков. Мутации в промоторном участке гена TEM-1 могут привести к гиперпродукции этих ферментов. Подобная гиперпродукция может обернуться устойчивостью к другим β-лактамным антибиотикам, помимо пенициллина. Точечные мутации в этих ферментах могут привести к возникновению устойчивости к ингибиторам β-лактамаз, например, сульбактаму и клавулановой кислоте (4). Устойчивые штаммы особенно опасны при лечении инфекций у детей, когда препаратами выбора являются пенициллины и ранние цефалоспорины. При неадекватной терапии существует риск перехода заболевания в хроническую форму.

Для обнаружения генов устойчивости к пенициллинам и ранним цефалоспоринам разработаны следующие наборы:

Резистентность к пенициллинам – 1

Резистентность Enterobacteriaceae и Pseudomonas к пенициллинам и ранним цефалоспоринам. (Гены TEM)

Резистентность к пенициллинам - 2

Резистентность Enterobacteriaceae к пенициллинам и ранним цефалоспоринам. (Ген SHV-не ESBL)

 

Необходимость обнаружения генов, ответственных за продукцию β-лактамаз расширенного спектра действия (ESBL)

Среди грамотрицательных бактерий гены blaSHV, blaTEM, blaCTX и blaAMPC, встречающиеся у E. coli, K. pneumoniae и Acinetobacter spp, кодируют β-лактамазы расширенного спектра (ESBL) и чаще всего располагаются на плазмидах. (5). ESBL - это β-лактамазы, способные гидролизовать все пенициллины и цефалоспорины за исключением цефамицина, моксалактама и карбапенемов. (6). Варианты blaSHV, blaTEM, устойчивые к широкому спектру антибиотиков, образовались в результате мутаций генов TEM-1 и SHV-1. Наиболее часто встречаются CTX-M - продуцирующие грамотрицательные палочки. Во всем мире отмечается, что изоляты E.coli, продуцирующие ферменты типа CTX-M (особенно CTX-M-15), являются важной причиной инфекций мочевыводящих путей и инфекций крови (7).

Для обнаружения устойчивости энтеробактерий к цефалоспоринам разработан набор:

• Резистентность к цефалоспоринам - 1

Резистентность Enterobacteriaceae к цефалоспоринам. (Гены CTX-M)

 

Необходимость обнаружения генов, ответственных за продукцию металло-бета-лактамаз, или карбапенемаз 

Карбапенемы, главным образом имипенем и меропенем, являются основными агентами в борьбе с грамотрицательными палочками, обладающими множественной лекарственной устойчивостью. В этой связи распространение грамотрицательных бактерий, продуцирующих карбапенемазы, представляет серьезную проблему в сфере здравоохранения.

С 2009 года Национальная референсная лаборатория Германии отслеживает молекулярную эпидемиологию карбапенемаз грамотрицательных нозокомиальных патогенов. В 2011 среди 1454 бактериальных изолятов устойчивость к карбапенемам была обнаружена у 34,4% штаммов Enterobacteriaceae, 19,9% штаммов Pseudomonas aeruginosa и в 96,3% изолятов Acinetobacter baumannii.

Карбапенем-устойчивые Enterobacteriaceae резистентны почти ко всем антибиотикам и в 40% случаев приводят к смерти пациента. В США за 2009-2010 годы в 13% случаев инфекций кровотока и катетер-ассоциированных инфекций мочевыводящих путей, вызванных Klebsiella, возбудитель был устойчив к карбапенемам. Для E.coli этот показатель составил около 2% (8).

Наиболее частыми карбапенемазами среди Enterobacteriaceae являются OXA-48, KPC и VIM-1, у Pseudomonas aeruginosa - VIM-2 (9).

Продуцирующие их гены расположены на интегронах и могут легко встраиваться в плазмиды или хромосомы. Таким образом, довольно просто происходит обмен этими генами как внутри бактериальной популяции одного вида, так и между различными видами (например, Pseudomonas может обмениваться генетической информацией как с другими Pseudomonas, так и с другими грамотрицательными палочками). Для многих ферментов (GIM, VIM, SPM и IMP) до сих пор не разработаны ингибиторы.

Распространение NDM-1 гена, кодирующего Нью-Дели металло-β-лактамазу (NDM-1) в Enterobacteriaceae, является одной из основных проблем глобального здравоохранения.

Продукт гена NDM-1 способен гидролизовать практически все β-лактамные антибиотики и в сочетании с другими механизмами резистентности делает бактерию устойчивой почти ко всем антибиотикам.

Первоначально плазмиды, кодирующие blaNDM-1, были обнаружены у  Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli. Посредством конъюгации плазмиды могут передаваться и другим видам. Недавно blaNDM-1 были обнаружены в Acinetobacter baumannii и Vibrio cholerae  (10).

NDM ферменты, такие как NDM-4, сейчас эволюционируют в более каталитически активные варианты (11).

Инфекции крови, вызванные  OXA-48-продуцирующими Enterobacteriacea, имеют плохой прогноз, поскольку часто происходит задержка между постановкой диагноза и началом адекватной терапии (12)

Обнаружение способности продуцировать металло-β-лактамазы различными представителями грамотрицательных бактерий, оценка масштабов встречаемости кодируемых их генов в клинических образцах важны для предотвращения распространения инфекции и проведения адекватной этиологической терапии пациентов (13).

Задачу обнаружения генов, кодирующих карбапенемазы, решают следующие наборы:

Резистентность к карбапенемам - 1

Резистентность Enterobacteriaceae и Pseudomonas к карбапенемам. (Гены VIM)

Резистентность к карбапенемам - 2

Резистентность Enterobacteriaceae к карбапенемам. (Гены NDM)

Резистентность к карбапенемам - 3

Резистентность Enterobacteriaceae к карбапенемам. (Гены OXA-48)

 

Грамположительные бактерии, как правило, реализуют устойчивость к β-лактамным антибиотикам за счет модификации пенициллин-связывающих белков (ПСБ), являющихся их мишенями действия. В частности, стафилококки способны синтезировать ПСБ2а, обладающий сниженной аффинностью к пенициллинам (метициллину и оксациллину) и цефалоспоринам. Способность к продукции такого белка кодируется геном MecA, передающимся в популяции в составе мобильной хромосомной кассеты.

Золотистый стафилококк способен поражать практически любые ткани организма человека, вызывая пневмонии, сепсис, остеомиелиты, маститы, инфекции кожи и тканей, мочевыводящих путей и др. Наличие гена MecA у S. aureus обуславливает его “метициллин - резистентность” – устойчивость к цефалоспоринам, часто сопровождающуюся множественной устойчивостью к другим классам антибиотиков. Устойчивые штаммы, обозначаемые как MRSA, часто выявляются при заражении крови и осложненных инфекциях мочеполовой системы. При лечении инфекций кожи и мягких тканей, особенно в развивающихся странах, метициллин-резистентный золотистый стафилококк нельзя сбрасывать со счетов. (14).

Для обнаружения метициллин - резистентных штаммов золотистого стафилококка предназначен набор:

Резистентность к цефалоспоринам- 2

Резистентность S. aureus к β-лактамным антибиотикам. (Ген MecA)

 

Гликопептидные антибиотики - ванкомицин и тейкопланин в терапии энтерококковых инфекций

Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium являются причиной 85-90% энтерококковых и третьей по частоте причиной внутрибольничных инфекций, особенно бактериемии, сепсиса у детей, эндокардита, инфекций мочевыводящих путей. Большинство больничных изолятов энтерококков устойчивы к обычным антибиотикам, устойчивость к ванкомицину достигает 40% популяции. Два гена резистентности (VanА и VanB) являются наиболее распространенными, особенно среди E. faecium. Штаммы с VanА геном устойчивы к ванкомицину и тейкопланину, штаммы с VanB устойчивы к ванкомицину, но сохраняют чувствительность к тейкопланину.

Ванкомицин-устойчивые энтерококки (VRE) являются важными этиологическими агентами внутрибольничных инфекций. Частота обнаружения VRE особенно высока в отделениях интенсивной терапии новорожденных в связи с иммунной недостаточностью у новорожденных, частым использованием антибиотиков и длительного срока госпитализации (15).

По данным последних публикаций метод ПЦР является наиболее быстрым и чувствительным методом для одновременного обнаружения энтерококков и определения их резистентности к ванкомицину. Среднее время проведения ПЦР и стандартного микробиологического исследования занимает 10 часов и 5 дней, соответственно (16).

Для выявления устойчивости энтерококков к гликопептидным антибиотикам разработан набор:

Резистентность к гликопептидам

Резистентность E. faecalis и E. faecium к ванкоминицу и тейкопланину. (Фенотипы VanA и VanB).

Использование ПЦР - наборов ООО НПФ “Литех” позволяет быстро и качественно выявлять генетически обусловленную устойчивость микроорганизмов к антибиотикам и способствует выбору адекватной лекарственной терапии.

 

Литература:
 
1) Flamm RK et al. Summary of ceftaroline activity against pathogens in the United States, 2010: report from the Assessing Worldwide Antimicrobial Resistance Evaluation (AWARE) surveillance program. Antimicrob Agents Chemother. 2012 Jun;56(6):2933-40.
2) Ekadashi R Sabharwal. Antibiotic Susceptibility Patterns of Uropathogens in Obstetric Patients. N Am J Med Sci. 2012 July; 4(7): 316–319.
3) Khosravi Y et al. Phenotypic detection of metallo-β-lactamase in imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa. ScientificWorldJournal. 2012;2012:654939.
4) Kiiru J et al. Analysis of β-lactamase phenotypes and carriage of selected β-lactamase genes among Escherichia coli strains obtained from Kenyan patients during an 18-year period. BMC Microbiol. 2012 Jul 28;12:155.
5) Huang XZ et al. Characteristics of plasmids in multi-drug-resistant Enterobacteriaceae isolated during prospective surveillance of a newly opened hospital in Iraq. PLoS One. 2012;7(7):e40360.
6) Mariani-Kurkdjian P, Doit C, Bingen E. Extended-spectrum beta-lactamase producing-enterobacteriaceae. Arch Pediatr. 2012 Nov;19 Suppl 3:S93-6.
7) Pitout JD. Enterobacteriaceae that produce extended-spectrum β-lactamases and AmpC β-lactamases in the community: the tip of the iceberg? Curr Pharm Des. 2012 Aug 29.
8) Kallen A, Guh A. United states centers for disease control and prevention issue updated guidance for tackling carbapenem-resistant enterobacteriaceae. Eurosurveillance, Volume 17, Issue 26, 28 June 2012.
9) Kaase M.Carbapenemases in gram-negative bacteria : Current data and trends of resistance resulting from the work of national reference centres. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 2012 Nov;55(11-12):1401-4.
10) Chen YT et al. Sequence of Closely Related Plasmids Encoding bla(NDM-1) in Two Unrelated Klebsiella pneumoniae Isolates in Singapore. PLoS One. 2012;7(11):e48737.
11) Warnes SL, Highmore CJ, Keevil CW. Horizontal transfer of antibiotic resistance genes on abiotic touch surfaces: implications for public health. MBio. 2012 Nov 27;3(6).
12) Navarro-San Francisco C et al. Bacteraemia due to OXA-48-carbapenemase-producing Enterobacteriaceae: a major clinical challenge. Clin Microbiol Infect. 2012 Nov 2.
13) Forozsh FM et al. Drug resistance pattern of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from cystic fibrosis patients at Isfahan AL Zahra hospital, Iran (2009-2010). Iran J Microbiol. 2012 Jun;4(2):94-7.
14) Sobhy N et al.Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus from skin and soft tissue infections (in a sample of Egyptian population): analysis of mec gene and staphylococcal cassette chromosome. Braz J Infect Dis. 2012 Sep-Oct;16(5):426-31.
15) Benzer D et al. Vancomycin-resistant enterococcus colonization in neonatal intensive care unit: prevention and eradication experience. Mikrobiyol Bul. 2012 Oct;46(4):682-8.
16) Honarm H et al.Evaluation of a PCR assay to detect enterococcus faecalis in blood and determine glycopeptides resistance genes: van a and van B. Iran J Med Sci. 2012 Sep;37(3):194-9.

Скачать прайс-лист Скачать прайс-лист
Лицензии. Сертификаты. Регистрационные удостоверения Лицензии. Сертификаты. Регистрационные удостоверения
Поликлиника НИИ Физико-химической медицины Поликлиника НИИ Физико-химической медицины
НИИ Физико-химической медицины НИИ Физико-химической медицины
Медицинские анализы Медицинские анализы www.analyz24.ru
О нас  | 
© Литех 1992-2017.
Разработка сайта - InterLabs.